三代测序翻车率飙升？试试文库回收让「垃圾数据」清零！

第三代测序技术是指单分子测序技术，也叫从头测序技术，长读长、无需扩增的特点让它看起来充满吸引力。2023 年，人类基因组端粒到端粒（T2T）完成图登上《Science》封面，三代测序技术正式封神。但不同于二代测序能接受部分降解的 DNA 样本，三代技术对 DNA 完整性极为敏感。此前往往通过传统切胶回收收集目标大片段，但操作繁琐、样本损失大，而磁珠法则难以精准区分大小相近的片段。因此相当大的样本因质检失败从而未进入测序环节，又或者短片段存在过多抢占测序芯片通道，导致有效数据量暴跌，长读长测序的光环之下，暗藏着一场样本质检的生存危机。对三代样本的成功质控是测序成功的关键。

最近，由 HudsonAlpha 生物技术研究所的协作实验室（CoLab）发布的一份技术说明为上述问题指明了思路。研究者验证了 LightBench® Discover 仪器对高分子量（HMW）DNA 质量（3-75kb）的评估能力，结果证明 LightBench® Discover 能有效评估 HMW gDNA 样本的质量与降解状态——甚至可检测出单次移液混合操作产生的影响。 

图 1 LightBench®Discover 在电泳过程中捕获的凝胶图像

CoLab 实验室将 LightBench® Discover 整合至其 PacBio 全基因组测序（WGS）工作流程中，该设备用于在三个关键阶段（图2），分别是高分子量（HMW）DNA 阶段、剪切后 DNA 阶段及最终 HiFi DNA 文库阶段。2025 年 1 月至 6 月期间，CoLab 实验室通过此工作流程处理 1199 份样本（1051 份 HMW 分析+148 份 HMW 片段回收），全程使用 LightBench® Discover 进行质控与片段回收。

​图 2 LightBench® Discover 长读长测序工作流程整合的示意图

较小 DNA 片段的优先测序会降低HiFi平均读长与数据质量。该研究表明 LightBench® Discover 基于凝胶的片段回收技术可以去除＜10 kb 的 DNA 片段，使后续测序的平均读长增加。作者特别指出此工作流程中未使用 PacBio 小片段去除试剂盒（SRE），因片段回收已满足需求。最终经片段回收的 SMRTbell 文库在 LightBench® Discover 上的片段长度分析显示：小 DNA 片段被完全去除，且 SQN 值（样本完整性评估值）较剪切后 DNA 显著提升（图 3）。所测文库大小用于指导测序前的摩尔稀释浓度计算。

图 3 测序前 HiFi 文库最终质控的电泳图谱轨迹叠加图

而在一项对比案例中，CoLab 研究者将同一提取的 gDNA 分别制备两份 SMRTbell 文库——其中一份使用 LightBench® Discover 进行片段回收。经片段回收的文库产生的HiFi平均读长更长，且＞10 kb 片段的读段数量增加。此外，甲基化检测数据显示片段回收不影响 DNA 甲基化状态（图 4）。

图 4 两份 SMRTbell 文库结果

HudsonAlpha的CoLab 已成功将 LightBench® Discover 应用于 PacBio WGS 工作流程，通过其执行精确的基于凝胶的片段回收及所有样本的片段长度质控。LightBench® Discover 的凝胶片段回收技术可稳定去除＜10 kb 的 DNA 片段，提高 HiFi 平均读长。片段长度分布数据支撑工作流程关键环节的实时决策，包括：HMW DNA 质量评估、DNA 打断效果检测和最终 DNA 文库大小与质量验证。LightBench® Discover 为长读长测序应用提供了集成式片段回收与质量控制的可靠解决方案。