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这个 ctDNA 检测「放大镜」，千万不要错过
人阅读 发布时间：2023-11-23 15:43
cfDNA（cell free DNA） 指存在于人体血液循环中的、游离于细胞外的高度片段化 DNA。在特定情况下（如肿瘤患者、孕妇、接受器官移植的患者等），一小部分来自“异源性”细胞的 cfDNA（如肿瘤细胞、胎儿细胞、或供体细胞）可以作为基因检测的标志物。在 1977 年，Leon 等人就发现，肿瘤患者的血浆游离 DNA 水平要明显高于健康人群[1]；cfDNA 中肿瘤细胞释放出来的肿瘤特有突变的那一小部分DNA 也称为ctDNA。研究发现，在肿瘤患者中，肿瘤来源的 ctDNA要短于背景 cfDNA，利用该特征，如果对 cfDNA 进行片段筛选，能提高检测的灵敏度。[2]
LightBench® 全自动核酸片段回收系统能实现不同片段大小的核酸的全自动富集回收。基于 LightBench® 的这一功能，可以对游离 DNA 进行片段筛选，提高检测的灵敏度。2020 年，其与 labcrop 合作 AACR 上发表了题为《Size selection of cell-free DNA increases the proportion of tumor specific variants in cancer patients》的应用文献，表明通过片段筛选后，可以将 ctDNA 的信号值平均提升了44%。
实验从 46 个健康人和 22 个癌症患者中正常提取 cfDNA，其中正常人 cfDNA的长度中位数在 169bp，癌症患者的片段中位数为 165bp，未表现出显著差异。
图1 片段筛选前后健康人群和癌症患者的 cfDNA 长度
使用 LightBench® 对片段进行回收，设定回收大小为 145bp(±15bp),回收后的正常人 cfDNA 的片段中位数为 129bp，而肿瘤患者的片段中位数在 120bp。
再将筛选前后的 cfDNA 进行建库测序，通过数据分析获得变异拷贝数(CNAs)。
图2 片段前后 CNAs 的 AUC 比率
如图 2 所示，AUC 比率=1 表示片段筛选后 CNA 检测无差异。AUC比率>1 表示片段筛选后 CNA 的信号增加。AUC 比率<1 表示片段筛选后 CNA 的信号下降。当评估来自健康患者的 cfDNA 时，平均 AUC 比率为 1.04，与在健康人群未做片段筛选前一致。然而，癌症患者中可检测到 CNA 的 AUC 比率为 1.97，说明筛选后 CNA 的检测信号增加。
文章还对不同大小的截止片段对检测信号的影响做了研究。综合多个研究，本篇文章验证了通过片段筛选可以提升 cfDNA 的检测阳性信号，可以通过降低无效测序数据量来降低检测成本。
此外 LightBench® 还可以在三代测序流程中应用，可以用于 Pacbio 10k 文库的片段筛选，如下表所示，平均回收率可达 80% 以上，多次筛选，回收率稳定。
另外针对 Nanopore 测序用户，由于系统芯片为生物活性的蛋白纳米孔这个原理的限制，初始样品纯度在很大程度上决定了测序结果准确性。使用 LightBench® 对样品进行片段筛选后建库，不仅会提升测序读长，还会提升仪器的数据量产出和芯片再次利用率。
LightBench® 采用 Ranger 专利技术进行全自动凝胶电泳，可实现一次自动回收1-12 个样品，不浪费试剂耗材，DN A回收率 80% 以上。同时兼容汉密尔顿机器人液体处理装置，可实现自动化 96 个样品的回收，帮助用户提升工作效率，简化工作流程，快速实现高通量核酸分析及核酸片段回收。
此外仪器附加片段检测和荧光浓度测定功能，可以最快在 20分钟内完成 96 个样品电泳检测，荧光浓度定量范围为 0.2ng/ul-100ng/ul。峰图跟浓度的结合可以更好地运用于二代测序中文库质控的浓度均一化。
杭州厚泽生物作为 LightBench® 中国地区指定经销商，可以为广大有需求的用户提供销售、推广和售后三位一体的服务，期待进一步推进业内核酸研究与检测领域的发展！
[1].Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M. & Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646–650 (1977)
[2].https://www.newscientist.com/article/2184604-blood-test-can-spot-dna-from-eight-different-types-of-cancer/
LightBench® 全自动核酸片段回收系统能实现不同片段大小的核酸的全自动富集回收。基于 LightBench® 的这一功能，可以对游离 DNA 进行片段筛选，提高检测的灵敏度。2020 年，其与 labcrop 合作 AACR 上发表了题为《Size selection of cell-free DNA increases the proportion of tumor specific variants in cancer patients》的应用文献，表明通过片段筛选后，可以将 ctDNA 的信号值平均提升了44%。
实验从 46 个健康人和 22 个癌症患者中正常提取 cfDNA，其中正常人 cfDNA的长度中位数在 169bp，癌症患者的片段中位数为 165bp，未表现出显著差异。
图1 片段筛选前后健康人群和癌症患者的 cfDNA 长度
使用 LightBench® 对片段进行回收，设定回收大小为 145bp(±15bp),回收后的正常人 cfDNA 的片段中位数为 129bp，而肿瘤患者的片段中位数在 120bp。
再将筛选前后的 cfDNA 进行建库测序，通过数据分析获得变异拷贝数(CNAs)。
图2 片段前后 CNAs 的 AUC 比率
如图 2 所示，AUC 比率=1 表示片段筛选后 CNA 检测无差异。AUC比率>1 表示片段筛选后 CNA 的信号增加。AUC 比率<1 表示片段筛选后 CNA 的信号下降。当评估来自健康患者的 cfDNA 时，平均 AUC 比率为 1.04，与在健康人群未做片段筛选前一致。然而，癌症患者中可检测到 CNA 的 AUC 比率为 1.97，说明筛选后 CNA 的检测信号增加。
文章还对不同大小的截止片段对检测信号的影响做了研究。综合多个研究，本篇文章验证了通过片段筛选可以提升 cfDNA 的检测阳性信号，可以通过降低无效测序数据量来降低检测成本。
此外 LightBench® 还可以在三代测序流程中应用，可以用于 Pacbio 10k 文库的片段筛选，如下表所示，平均回收率可达 80% 以上，多次筛选，回收率稳定。
表1 不同投入量下 Pacbio 10k 文库的回收率
（*浓度测定使用Qubit 4.0）
| 重复 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 实际测得投入量* | 1.54ug | 0.7ug | ||||
| 实际测得回收量* | 1.23ug | 1.32ug | 1.19ug | 0.56ug | 0.58ug | 0.66ug |
| 回收效率 | 80% | 86% | 78% | 78% | 81% | 92% |
另外针对 Nanopore 测序用户，由于系统芯片为生物活性的蛋白纳米孔这个原理的限制，初始样品纯度在很大程度上决定了测序结果准确性。使用 LightBench® 对样品进行片段筛选后建库，不仅会提升测序读长，还会提升仪器的数据量产出和芯片再次利用率。
LightBench® 采用 Ranger 专利技术进行全自动凝胶电泳，可实现一次自动回收1-12 个样品，不浪费试剂耗材，DN A回收率 80% 以上。同时兼容汉密尔顿机器人液体处理装置，可实现自动化 96 个样品的回收，帮助用户提升工作效率，简化工作流程，快速实现高通量核酸分析及核酸片段回收。
此外仪器附加片段检测和荧光浓度测定功能，可以最快在 20分钟内完成 96 个样品电泳检测，荧光浓度定量范围为 0.2ng/ul-100ng/ul。峰图跟浓度的结合可以更好地运用于二代测序中文库质控的浓度均一化。
杭州厚泽生物作为 LightBench® 中国地区指定经销商，可以为广大有需求的用户提供销售、推广和售后三位一体的服务，期待进一步推进业内核酸研究与检测领域的发展！
[1].Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M. & Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646–650 (1977)
[2].https://www.newscientist.com/article/2184604-blood-test-can-spot-dna-from-eight-different-types-of-cancer/
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