多重降落 PCR (MT-PCR)： PCR 新应用成就更好的精确性和稳定性

MT-PCR 是什么?

聚合酶链式反应，或称之为 PCR，已使用近 30 年，在各种生化和医学实验室均有应用。然而，PCR 最突出的问题是非靶 DNA 扩增，导致各种问题，尤其是假阳性结果。幸好多年来 PCR 技术在不断进步，发展出一种新型 PCR 技术——多重降落 PCR（MT-PCR）。MT-PCR 结合了多重 PCR 和降落 PCR 的特征。在一项 PCR 实验中，采用了多种引物检验多重 DNA 靶标。每个周期的退火温度从原设定温度降低 0.5～1°C，直到达到最佳退火温度。

MT-PCR，出现在 2016 年*的一项新研究中^（1），发展该技术旨在检测抗性基因。MT-PCR 成功地识别出数个不同的靶细菌 DNA，还阻止非靶 DNA 扩增反应，从而阻止假阳性结果。

MT-PCR 如何解决多重 PCR 面临的问题？

常规 PCR 试验的目标是单个 DNA 模板，特定的引物会在 20 个反应周期内将模板扩增。在一个反应中采用多个引物和靶 DNA，可节省大量时间，还能同时在一个 PCR 中扩增多个靶 DNA*⁽²⁾。

但是，多重 PCR 有一个严重的缺点，很难在引物和 DNA 混合物中避免非靶 DNA 交叉扩增。因此，进行多重 PCR 前，我们必须提前选择特定的靶 DNA。只选择不同 DNA 配对长度的靶 DNA 进行多重 PCR。

虽然，多重 PCR 节省时间，但仍无法避免非靶 DNA 交叉扩增导致的错误。因此，我们需要 MT-PCR。MT-PCR 和多重 PCR 的主要差别在于退火温度。MT-PCR 的退火温度随每个周期降低。设定的第一个周期（起始）退火温度比预期温度高 3～5°C 。一般而言，退火温度越高，引物和模板匹配越好。缓慢降低退火温度让 PCR 更有效。

精确而稳定地控制温度至关重要

本项 MT-PCR 研究的研究者在血液培养瓶和加标血液瓶中成功地识别了 5 个靶 DNA，mecA, Blashv, Blactx-M, BlaTem 和 Blaoxa，参见图 1。同时，没有交叉扩增和假阳性结果。（图 2），试验中，在热循环仪上设定的起始退火温度为 66℃，30 秒。研究者将反应继续进行，但是每个周期退火温度降低 0.5℃。温度控制的精确性和稳定性非常重要。BlueRay Biotech 生产的 TurboCycler2 热循环仪非常稳定，可精确而稳定地控制温度。该仪器的升降温速度快，可迅速设定需要的特定温度。还有一个样品模式，将样品和受试块的温差控制在最小绝对值。TurboCycler2 是研究者进行 MT-PCR 的理想选择。

图. 1

图 1   来自 12 个加标血液培养瓶的样品的 MT-PCR 结果。第 9～第 13 是靶基因的对照组。第 1～第 8 明确显示靶基因在 MT-PCR 阵列中表达，且无其他交叉扩增。

图 2.   来自 33 个阳性血液培养瓶的样品在 4 h MT-PCR 阵列的结果。明确显示靶基因，且无非靶基因表达。

在本项研究中，靶细菌 DNA 含有多重抗生素耐药性基因。被这些细菌感染的患者要及时接受正确的抗生素治疗，否则败血症会导致严重的后果。该项研究工作证明，MT-PCR 可迅速鉴别有关细菌。

结论

MT-PCR 不但可以迅速识别样品中多个靶细菌的基因，而且，还可以避免非靶 DNA 交叉扩增。与以往相比较，假阳性结果明显更少，这对临床研究和诊断具有重大意义。我们希望不久的将来，MT-PCR 有更多的应用。为取得最佳 PCR 结果，选择一个优秀的热循环仪也是非常重要的。

参考文献：

1. Ming-Yi W, Jian-Li G, Ying-Jian C, Yu S, Mei S, Hai-Zhu L and Cheng-Kin H.

Direct Detection of mecA, blaSHV, blaCTX-M, blaTEM, and blaOXA Genes from Positive Blood Culture Bottles by Multiple-touchdown PCR Assay.

2. Henegariu O, Heerema N A, Dlouhy, S R, Vance, G H and Vogt, P H (1997) Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol. Biotechniques 23, 504-511.